【技术干货】CAR-T阳性率检测的最佳组合——流式细胞术与生物素-亲和素系统的联合应用

上个月，全球首个获得FDA批准上市的CAR-T细胞疗法Kymriah（tisagenlecleucel，曾用名CTL019，Novartis）正式开启了靶向细胞疗法的新纪元。尽管Kymriah目前只适用于治疗急性淋巴性白血病（ALL）的25岁以下患者，且价格不菲（诺华的CAR-T批了，Gilead股票也大涨了，但你真的治得起吗？），但这款药物的上市无疑增加了全球诸多从事CAR-T研发和应用的企业和机构的信心（CAR-T的春天就要来了，你准备好了吗？）。 随着CAR-T细胞疗法的实力渐渐浮出水面，越来越多的国内外药企、科研机构以及投资机构纷纷投入其中。

截止今年4月底，据BiStro Biotech Consulting公司统计，共计有145个CAR-T或CAR-NK疗法处于临床试验阶段。

其中热门靶点包括如下所示，可以看到最热门的CD19分子已有53个基于CAR-T, TCR-T或CAR-NK疗法的临床一期实验。

Kymriah作为一款基于基因改造的靶向CD19的自体T细胞免疫疗法，它的治疗需要先从个体患者的体内提取出T细胞，并在生产中心进行遗传改造。在那里，这些T细胞会被引入全新的嵌合抗原受体（CAR），使T细胞有能力直接靶向并杀伤带有CD19抗原的白血病细胞。当这些T细胞改造完成后，就会被回输到患者体内，进行治疗。

图1 CAR-T细胞疗法的治疗过程

在Kymriah的整个治疗过程中，CD19 CAR表达情况的检测是关键环节之一。目前，流式细胞术是CD19 CAR表达情况检测的最常用方法。下面，小编以一篇发表于Molecular Therapy的文章为例，为大家简要解读如何利用流式细胞术检测CD19 CAR的表达情况。（获取文献原文方法见本文末尾）

首先，我们来了解一下文章中CD19 CAR-T细胞的构造。 CD19 CAR-T细胞的核心部件为CD19 CAR，主要由CD19的单链抗体（克隆号：FMC63）片段（ScFv）、CD8a的铰链和跨膜区、共刺激分子4-1BB和CD3ζ胞内信号区串联而成（见图2）。

图2 CD19 CAR-T细胞结构示意图

CD19 CAR 作为CD19 CAR-T细胞的核心部件，其表达情况决定了CD19 CAR-T细胞制备的成败。文章中MacLeod et al.就是通过检测CD19 CAR的表达来评估基因编辑同种异体CD19 CAR-T细胞制备成功率。

接下来，我们就来看一看文章中是如何利用流式细胞术检测CD19 CAR的表达的。

流式细胞仪：BD Fortessa flow cytometer (BD Biosciences)

主要试剂：生物素标记的CD19-Fc蛋白 (Cat.No.CD9-H8259) 购自ACROBiosystems公司，PE标记的链霉亲和素（Streptavidin-PE）和anti-CD3-BV711抗体购自BioLegend公司。

检测样品：Mock nucleofected T细胞组和TRC1-2 nucleofected T细胞组

检测原理：生物素-亲和素系统、抗原-抗体系统和流式细胞分析技术相结合（见图3）。

图3 流式细胞术检测T细胞表面CD3分子和CD19 CAR表达的原理示意图

简要检测流程：

第一步：利用CD19 CAR能特异性结合CD19蛋白的特性，如果待检T细胞正常表达了CD19 CAR，生物素标记的CD19-Fc蛋白就能被标记到待检T细胞表面；

第二步：利用生物素能特异性结合亲和素（Streptavidin-PE）和Anti-CD3-BV711抗体能特异性结合CD3分子的特性，如果待检T细胞表面有生物素和CD3分子，链霉亲和素上的PE和Anti-CD3抗体上的BV711荧光标记就能被标记到待检T细胞表面；

第三步：将制备好的单细胞悬液上机进行流式细胞分析。

检测结果：

利用流式细胞术对两组待检T细胞表面CD3分子和CD19 CAR表达情况的检测结果显示，CD3阴性T细胞群中CD19 CAR表达的比例要高于CD3阳性T细胞群。

图4 流式细胞术检测CD19 CAR-T细胞表面CD3分子和CD19 CAR表达情况

流式细胞术作为一种在功能水平上对单细胞进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等诸多优势，而生物素-亲和素系统的高亲和力牢固结合和多级放大效应，使得该系统在与流式细胞术结合使用时，细胞定量分析更加灵敏简便。

ACROBiosystems开发了一系列针对CAR-T的靶点蛋白，其中包括许多生物素预先标记的蛋白，这些生物素预先标记的蛋白适用于Biopanning来筛选ScFv， 以及后续检测CAR表达和筛选CAR表达的细胞。

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参考文献：

[1] MacLeod et al., Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells, Molecular Therapy (2017) http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.02.005

[2] William R. Strohl, Current progress in innovative engineered antibodies, Protein Cell (2017)

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