MHC-多肽复合物四聚体——深挖HPLC纯度控制要点

A:团子博士：

不同孔径的HPLC柱子具有不同的分离分级范围，这会直接影响分析得到的HPLC谱图，需要根据待测蛋白的分子量选择正确的柱子型号。如从某HPLC厂家资料来看，G2000柱分级范围5-150kDa，那么，理论上150kDa以上的蛋白会在外水出峰，无法分辨150kD以上的蛋白。从下面的样品分离图谱可以看出，使用G2000柱子，160kD的IgG和660kDa的甲状球蛋白（某检测样本）分离度非常小（黄色区域），而MHC四聚体分子量258kDa左右，如果2个或更多四聚体进一步产生八聚或高聚，分子量会是516kDa或更高MHC四聚体，基于此可以预见，如果两个峰之间（黄色区域）再插入258kD和516kD的两个峰，将无法有效分离开，MHC四聚体和高聚体会合并为一个峰在外水被洗脱出来，导致MHC四聚体纯度分析结果虚高，因此选择合适的HPLC柱子进行MHC四聚体分析，对于分析结果非常关键!

色谱柱：TSKgel SWXL 系列，7.8mm ID x 30cm; 

溶剂：0.05mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7）+ 0.3mol/L NaCl; 

流速：1mL/min; 

柱温：25℃;

检测：UV@220nm样本：1.甲状球蛋白（thyroglobulin, 660kDa）2. IgG（160kDa） 3.牛血清白蛋白（BSA, 67kDa） 4.核糖核酸酶 A（ribonuclease A, 13kDa） 5. VB12 （1.3kDa）

A: 团子博士：

当然可以，以HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer为例，其理论分子量为258KDa，参考厂家不同HPLC柱子的分级范围，G2000柱分级范围5-150kDa，G3000柱子分级范围是10-500kDa，将HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer（Company K）分别使用G2000柱和G3000柱进行验证分析，结果发现两种柱子下的测试结果有非常明显的差异！

▶使用G3000SWXL柱子时的HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer（Company K）聚集纯度检测结果

设备：安捷伦HPLC 1260 高效液相色谱仪,怀雅特MALS DAWN8；

色谱柱：G3000SWXL，7.8mm ID x 30cm；

溶剂： 0.2M Na2HPO4,1%IPA,pH7.0；

流速： 0.5 mL/min；

柱温： 25℃；

检测： UV@280nm；

样品： Human HLA-A*02:01&B2M&NY-ESO-1 (SLLMWITQC) Tetramer Protein (Company K）

▶使用G2000SWXL柱子时的HLA-A2/NY-ESO-1 Tetramer（Company K）聚集纯度检测结果

设备：安捷伦HPLC 1260 高效液相色谱仪,怀雅特MALS DAWN8；

色谱柱：G2000SWXL，7.8mm ID x 30cm；

溶剂： 0.2M Na2HPO4,1%IPA,pH7.0；

流速： 0.5 mL/min；

柱温： 25℃；

检测： UV@280nm；

样品： Human HLA-A*02:01&B2M&NY-ESO-1 (SLLMWITQC) Tetramer Protein (Company K）

根据结果，可看出，使用孔径较小的G2000SWXL，无法区分MHC四聚体和更高的聚集体，会导致分子量150k以上的所有组分合并成一个外水峰，掩盖四聚体的真实聚集状态，造成纯度检测结果虚高；而G3000柱子分级范围是10-500kDa，这样我们刚才说的160kD的IgG和660kDa的甲状球蛋白两个峰之间有了较大的余地，可以较好的区分MHC四聚体和高聚体（258kD和516kD等）。因此，这很好的验证了并非所有HPLC柱子都能体现其真实的MHC四聚体的纯度， 应选择型号为G3000的HPLC硅胶柱进行MHC四聚体的纯度分析，避免使用小孔径的G2000柱带来的纯度虚高的假象，干扰蛋白的性能评价和选择，对药物开发的结果造成无法预估的损失。