CAR-NK药物作用机制和药效学研究——细胞因子检测

CAR-NK (Chimeric Antigen Receptor NK-Cell) 是一种经嵌合抗原受体CAR修饰过的自然杀伤细胞 (Natural Killer cell, NK)。不同于T细胞，NK细胞的优势是本身无需预先致敏就能非特异性的杀伤肿瘤细胞，而在用CAR进行修饰后，CAR-NK被赋予了靶向识别肿瘤细胞的特异性，可以实现对肿瘤细胞的定向杀伤。同时，CAR-NK细胞寿命较短，在完成靶向杀伤后即消失，且正常情况下NK细胞本身不分泌促炎细胞因子IL-1和IL-6。这些特点大大降低了CAR-NK疗法后患者体内产生细胞因子风暴（Cytokine Release Syndrome，CRS）和神经毒性的风险，因此可以提供比CAR-T疗法更优秀的药物安全性。

随着国内外多家公司在CAR-NK疗法研发上的逐渐深入，越来越多的业内人士认为CAR-NK能成为继CAR-T后的具有巨大潜力的细胞疗法之一。截止到2024年12月，全球约有300条在研的CAR-NK疗法管线，其中超过30%的管线已经进入临床阶段，最高为临床2期。CAR-NK管线与CAR-T相似，均可针对非实体瘤和血液病。而除此之外，有将近20%的CAR-NK管线可针对治疗各类实体瘤，最高研发阶段已推进至临床1期。CAR-NK管线的总数量呈现逐年增长的趋势 (2021-2031年复合增长率为16.2%)，并且预计2031年全球NK细胞治疗市场规模将从2021年的3.4亿美元提升至15.795亿美元。

CAR-NK的作用机制依赖于CAR修饰后对肿瘤细胞的特异性识别，使NK细胞可以靶向识别肿瘤细胞后再进行杀伤。CAR-NK中嵌合抗原受体的构造包括了胞外的肿瘤识别结构域scFv、跨膜结构域和胞内信号结构域，其本身和CAR-T中嵌合抗原受体结构高度类似，保证其能够赋予NK细胞特异性的能力。

相比CAR-T，CAR-NK的优势之一是胞外识别结构域的选择更加多样。目前多数的CAR-T疗法依然主要针对非实体瘤治疗，主要的识别抗原也以CD19和BCMA居多。而CAR-NK除了可针对非实体瘤之外，在实体瘤上也展现出良好的药效，其scFv端可以识别的实体瘤靶向抗原包括Mesothelin (MSLN)、HER2、EGFRvIII、NKG2D、GD2等（图1）。

图1. 常见的CAR-NK胞外识别结构域靶向抗原及对应CAR结构

当CAR-NK的scFv端成功识别肿瘤细胞后，NK细胞开始对其实行杀伤。这其中主要有以下三种细胞杀伤机制：

图2. NK细胞杀伤肿瘤细胞的机制

CAR-NK疗法的显著优势包括更良好的实体瘤疗效，以及无需提前激活的非特异性肿瘤细胞杀伤能力。除这两点之外，NK细胞本身的半衰期较短，只有7-10天，通常在发挥杀伤作用之后即消失，也因此CAR-NK不会出现疗程后正常组织受细胞毒性杀伤的这一隐患。同时，在NK细胞的杀伤机制中会分泌IFN-γ、GM-CSF等细胞因子，并不包括CRS的主要诱因IL-1β和IL-6，这也大大降低了患者在疗程中发生CRS的概率。

更重要的是，NK细胞产生的来源广泛。NK可以从外周血、脐带血、人胚胎干细胞、诱导多功能干细胞和NK-92细胞系中产生。且经过临床样本验证，同种异体NK细胞的在体内的耐受性良好，并不会引发移植物抗宿主病（GvHD）以及高等级的神经毒性。因此综合来看，CAR-NK的毒副作用较小，或许可以提供比CAR-T更加优秀的药物安全性。

在药物开发和临床前阶段，研究人员在体外培养淋巴细胞并用不同剂量的CAR-NK细胞进行刺激。通过检测其分泌的细胞因子含量来分析评估CAR-NK药物在不同时间点下的药效。以上市公司Nkarta Therapeutic旗下的靶向CD19的临床阶段药物NKX019为例，其药物作用机制（Mechanism of Action）的建立包括了检测不同药物浓度刺激下，血浆样本中不同时间点的Granzyme B、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α细胞因子的分泌情况（图3）。

图3. NKX019体外细胞刺激实验

反观国内公司布局的CAR-NK管线，在2021年11月，国健呈诺拥有了国内首个获批IND的现货型异体来源CAR-NK注射液“靶向间皮素(MSLN)嵌合抗原受体NK细胞注射液”。在2023年12月，国健呈诺首次公示管线临床1期阶段信息(登记号CTR20234237)，明确治疗的适应症为晚期上皮性卵巢癌。这一产品的IND获批是CAR-NK细胞产品治疗实体瘤的一大重要突破，此后针对卵巢癌及其他实体瘤（如胃癌、肠癌等）的MSLN CAR-NK的管线数量开始上升。

继国健呈诺获批IND后，广州医科大学附属第二医院的MSLN CAR-NK 药物管线也于2022年6月宣布进入临床，其针对的适应症为晚期恶性实体瘤。已公布的文献中表明，在药物开发和临床前阶段，研究人员在体外共培养MSLN-CAR-NK细胞和靶细胞，使用ELISA检测细胞上清中的IFN-γ、GM-CSF、Granzyme B和perforin等生物标志物，以评估MSLN-CAR-NK的体外药效（图4）。

图4. MSLN-CAR-NK的体外细胞刺激标志物检测

综上，在CAR-NK药物开发过程中，细胞因子作为关键的检测指标，在早期药理药效研究、临床前及临床实验中，检测血清/细胞上清中这些细胞因子的分泌量，都能充分反应药物机制、免疫系统激活情况及药物安全性。目前，CAR-NK药物的在研管线数量呈逐年上升趋势，且市场前景广阔。为了加速CAR-NK药物研发，ACROBiosystems提供多种生物标志物（cytokine、biomarker）的定量分析ELISA试剂盒。试剂盒性能经过真实样本和实验的充分验证，保证分析结果的精确性、特异性、准确度、灵敏度和一致性。

• Human Granzyme B ELISA Kit (Cat. NO. CEA-B033) 

线性范围

ClinMax^TM人Granzyme B ELISA检测试剂盒的线性检测范围为3.906 pg/mL – 500 pg/mL，具体数据见图5。

图5. (A). CEA-B033试剂盒标准品线性检测数据(OD450nm-630nm); (B). CEA-B033试剂盒标准品四参数方程拟合线性图

批内、批间精密度

按本产品（CEA-B033）操作说明，测定3个浓度的质控品，每个质控品重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于10%，具体结果见图6。

按本产品（CEA-B033）操作说明，测定3个批次3个浓度的QC（pg/mL），每个质控品重复检测3次，计算9次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于15%，具体结果见图6。

图6. (A). CEA-B033批内精密度数据图；(B). CEA-B033批间精密度数据图及CV值

回收率

将本产品（CEA-B033）中的参考品，用样本稀释液分别配置成高值血清样本，按照1：19的体积比例加标到血清样本中。按照试剂盒说明书，每个样本均检测2次，求出检测结果的浓度值的平均值。回收率的计算公式=（加标样本值-Blank样本值*0.9）/理论值×100%, 本产品回收率平均值为104.4%（见下表1）。

表1. CEA-B033回收率数据

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• Human GM-CSF ELISA Kit (Cat. NO. CRS-B007) 

线性范围

ClinMax^TM人GM-CSF ELISA检测试剂盒的线性检测范围为12.5 pg/mL – 1600 pg/mL，具体数据见图7。

图7. (A). CRS-B007试剂盒标准品线性检测数据(OD450nm-630nm); (B). CRS-B007试剂盒标准品四参数方程拟合线性图

批内、批间精密度

按本产品（CRS-B007）操作说明，测定3个浓度的质控品，每个质控品重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于10%，具体结果见图8。

按本产品（CRS-B007）操作说明，测定3个批次3个浓度的QC（pg/mL），每个质控品重复检测3次，计算9次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于15%，具体结果见图8。

图8. (a). CRS-B007批内精密度数据图；(b). CRS-B007批间精密度数据图及CV值

回收率

将本产品（CRS-B007）中的参考品，用样本稀释液分别配置成高值血清样本，按照1：19的体积比例加标到血清样本中。按照试剂盒说明书，每个样本均检测2次，求出检测结果的浓度值的平均值。回收率的计算公式=（加标样本值-Blank样本值*0.9）/理论值×100%。本产品回收率都在102.82%的范围内（见下表2）。

表2. CRS-B007回收率数据

稀释线性

将本产品（CRS-B007）中GM-CSF参考品，用血清样本配置成为高值血清/血浆/细胞上清样本，用样本稀释液依次按1：1进行稀释，每个稀释浓度均检测2次，求检测结果的浓度值的平均值，结果显示，血清/血浆/细胞上清样本各稀释点的检测浓度应都在该待测物浓度标示值的±20%范围内，线性相关系数R2应大于0.95 (见图9)。

图9. CRS-B007稀释线性曲线图

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