【支原体专题】快速检测：保障生物制品质量的关键防线

支原体是柔膜菌纲中的一种特殊细菌，已知的支原体有190多种，广泛分布在人类、动物、昆虫和植物中。与其他细菌不同，支原体没有细胞壁，能通过细胞质交换从宿主细胞获取营养。此外，支原体是已知的最小独立生存的细菌之一，大小在0.15-0.3微米之间，微小的尺寸使其能够避开许多过滤系统，即使在细胞培养物中生长至高浓度，也不会使培养基变浑浊或显现明显的污染迹象。支原体的基因组较小，严重依赖外源的胆固醇、氨基酸、脂肪酸、维生素及其他宿主或环境提供的分解代谢产物。如果支原体污染未被及时发现，它将对细胞的生理状况产生多重危害，包括诱发染色体异常、干扰DNA和RNA合成、改变膜抗原性、因营养竞争抑制细胞增殖与代谢、降低转染率、改变基因表达谱，甚至导致细胞死亡。

多年来，多种细胞系被广泛应用于治疗或药用生物制品的生产，如细胞因子、病毒疫苗、单克隆抗体、生长因子和免疫调节剂等。近年来，基于细胞治疗、基因治疗的先进治疗药物（ATMPs）作为新型治疗手段，为多种疾病患者提供了全新的治疗方案。以自体细胞治疗为例，它需要从患者体内分离细胞，经过体外培养后再回注到患者体内。然而，该过程生产工艺复杂，涉及细胞获取、细胞培养、原料使用、细胞产品制备和储存等多个环节，在每一个环节都存在支原体污染的潜在风险。更重要的是，支原体污染在细胞治疗和生物制药行业中危害巨大，一旦细胞基质受到污染，不仅可能对患者的安全构成威胁，还可能导致产品问题或产品召回，从而带来严重的经济损失。这使得生物制药在生产及产品放行等过程均面临严峻挑战。因此，为最大程度降低风险，支原体的常规检测成为整个生物制药产品生产和研发过程中不可或缺的环节。

生物制药生产监测支原体污染范例

为了降低支原体污染风险，利用细胞系生产生物制品的全过程均需要进行支原体检测。支原体检测应遵循基本原则，检测细胞应尽量新鲜，培养物需在未使用抗生素的情况下传代培养3次或培养2周，并确保每次检测有适当的阳性和阴性对照。常见的支原体检测方法包括培养法、指示细胞法、DNA染色法、PCR法等。传统上，通常采用培养法/指示细胞法来判断生物制品是否被支原体污染。但培养法繁琐且耗时长，28天的检测周期对于半衰期短或需快速处理的产品而言是个巨大挑战，而指示细胞法的灵敏度低，难以满足高效检测的需求。

随着细胞治疗药物和其他先进治疗药物的发展，对支原体检测时效性和灵敏度要求越来越高，传统方法已无法满足其快速放行需求。因此，基于核酸扩增技术（Nucleic acid amplification technology, NAT）的PCR法，作为一种快速且可靠的替代方案脱颖而出。它在研究实验室中表现优异，搭建和分析过程迅速，灵敏度高、特异性强、可靠且具成本效益。目前，《欧洲药典》（EP）<2.6.7>、《日本药典》（JP）以及《美国药典》（USP）<63>都已收录NAT方法作为支原体检测方法。2020版《中国药典》（ChP）虽然并未收录NAT法作为支原体检测方法，但也提到了“也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法”。

• 覆盖度广，能覆盖250多种支原体及螺原体

• 灵敏度高，符合监管指南的要求标准(10 CFU/mL) 

对10个 mycoplasma standards（10 CFU/mL）中的每一个进行24次测试，所有测试结果均为阳性，符合或优于EP 2.6.7的要求（10 CFU/mL）。

• 特异性强，无交叉反应

与无关细胞系/菌株的交叉反应：对两种常见细胞系和四种无关菌种（肺炎链球菌，嗜酸乳杆菌，表皮葡萄球菌和芽孢杆菌）进行提取和检测，所有检测结果均为阴性。这表明该试剂盒的支原体检测不受无关细胞/菌株的影响。

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• 重组C因子内毒素检测试剂盒

• RNase / DNase残留检测试剂盒

• CHO DNA残留检测试剂盒

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参考文献 

1. Cara N. Wilder, PhD and Yvonne Reid, PhD. Mycoplasma quality control of cell substrates and biopharmaceuticals. ATCC WP-112021-v04.
2. Lesley Young, Julia Sung, Glyn Stacey, and John R Masters. Detection of Mycoplasma in cell cultures. nature protocols. VOL.5 NO.5 (2010)  doi:10.1038/nprot.2010.43

3. Phillip Angart, Casey Kohnhorst, Meng-Jung Chiang, and Nilou Sarah Arden. Considerations for risk and control of mycoplasma in bioprocessing. Current Opinion in Chemical Engineering 2018, 22:161–166. doi.org/10.1016/j.coche.2018.09.012