新一代单克隆抗体开发技术

单克隆抗体因其靶向性强、特异性高等特点被广泛应用于包括癌症、自身免疫疾病和感染性疾病在内的多种疾病的治疗和诊断。常用的单克隆抗体开发技术主要有传统的杂交瘤融合方法、噬菌体展示技术和新兴的B细胞克隆技术等，然而，这些技术均存在着一些目前无法完全克服的技术缺陷，比如筛选周期长、成本高、对操作人员技术能力的要求高等，很多生物科技企业和科研机构为了克服这些技术缺陷正不断进行着技术革新。本文将为大家介绍来自于优睿生物的基于单细胞克隆的新一代单克隆抗体开发技术——SMab^TM技术，此技术是革新后的B细胞克隆技术，具有快速、便捷、高通量等优势。

B细胞克隆技术是独立于杂交瘤融合技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。早期研究者首先尝试的方法是分离出表达抗体IgG的B细胞，然后利用EBV 病毒(Epstein-Barr Virus)使B细胞永生化（Immortalization），再通过单细胞分离技术，分离出单个B细胞再将其中编码抗体重链和轻链的基因克隆出来，最后通过体外重组表达进行验证，从而获得所需要的单克隆抗体。这一方法首先应用于从HIV、HBV或流感病毒感染的病人中获得全人源的单克隆抗体，并获得了成功。但利用EBV病毒永生化B细胞，对实验室的安全级别要求相对较高；同时永生化的B细胞生长缓慢且不稳定，不利B细胞的长期培养和使用。

而随着流式细胞筛选技术的发展，还衍生出了利用B细胞表面标记物、结合多色流式细胞设备分选出特异的B淋巴细胞，然后进行单个B细胞重链和轻链基因的克隆和体外表达。该方法的优点是，和杂交瘤细胞技术相似，所获得抗体的重链和轻链的配对，完全反映体内天然的配对情况；并且，该方法可以从外周血淋巴细胞中分离B细胞，不需要处死动物即可以完成筛选。但就如何从单个B细胞中获取编码相应单克隆抗体重链和轻链基因，目前有以下几种方法：

1.    单细胞直接PCR（Direct PCR from Single B cell）：从筛选获得的单个B细胞中直接PCR获取编码抗体的轻、重链基因。

2.    与二代测序技术（NGS）整合：即通过二代测序的方法，从筛选后的B细胞中获取编码抗体轻、重链信息。但该方法需要解决的问题是如何得知正确的抗体轻重链配对，从目前来看，存在着这些方法解决抗体的基因信息的配对问题：i)当获取了大量针对某一抗原的抗体信息后，通过生物信息学的方法来预测新获得序列的配对，但该方法需要大量的已知抗体信息，在实践上存在着困难；ii)通过在二代测序引物后面加不同标记序列（Tag）的方法，利用这些标记序列的信息来确定抗体轻、重链的配对情况；iii) CST公司在2012年开发了NG-XMT™ 技术，即利用NGS技术和蛋白质组技术相结合，通过抗原蛋白从经免疫后的动物外周血中富集抗体，通过质谱的方法来获取抗体的氨基酸序列信息，最后和NGS获得的基因序列信息进行比对来获取抗体的轻重链配对信息。

然而，利用上述方法来获得单克隆抗体，在商业化应用上面存在着以下一些劣势：

1、  这些技术路线大部分需依赖于单细胞PCR技术来扩增抗体的重链和轻链，因此对操作人员的技术要求、环境要求均比较高；并且，需要较多的循环数（一般>50）或者多轮PCR才能有效扩增出抗体的重链和轻链基因，因此目标基因中存在PCR介导突变的几率增加，有可能丢失功能性抗体。

2、  这些技术在获得了编码抗体的重链和轻链基因信息之后，还需要在体外进行重组表达验证，成本较高：扩增一块96孔板的B细胞抗体基因，并进行体外表达验证，其成本可高达5000-8000美元；而CST公司的NG-XMT™ 技术因需要和质谱技术联用，不但成本更加昂贵，而且在技术上要求也更加高。

3、  除了第2点所说的成本劣势之外，从单细胞中克隆抗体基因并进行体外表达验证，工作量大、时间长，因此，该方法不适用于大通量的筛选。

为了克服B细胞克隆技术的上述劣势，优睿生物开发了不同于上述方法的B淋巴细胞单细胞分选——培养——抗体基因克隆方案，即采用优化配方后的培养基，对分选获得的单个B淋巴细胞进行体外培养，刺激B细胞在体外实现增殖并分泌足够量的抗体IgG用于初级筛选。众所周知，分选获得的B淋巴细胞是原代细胞，对于原代细胞的培养一直是细胞生物学研究的一个难题；而优睿生物通过多年的研究和优化，实现了对单个B淋巴细胞的体外培养，培养周期可长达数周，识别抗原的单克隆B细胞阳性率（即分泌抗体IgG的比例）可达60%，且分泌抗体的浓度平均大于1ug/ml。优睿生物将该平台称之为基于单个B细胞的单克隆抗体筛选平台（Single B Cell Based Monoclonal Antibody Platform, SMab^TM）。

与单纯的B细胞分选和克隆方案相比，该方案存在着以下优势：

1、  SMab^TM技术平台可以通过抗原来有效富集识别特定抗原的B淋巴细胞，因此可以大大提高筛选和富集所获得B淋巴细胞的阳性率，比传统的杂交瘤细胞技术提供5-10倍。

2、  SMab^TM技术平台适合于高通量筛选，可以按需要达到每批筛选出2,000-10,000个识别靶标抗原的单个B细胞来培养，极大增加了初始抗体库的多样性，利于获得高性能的单克隆抗体及抗体化药物研发；同时抗体FACS分选有效保证了B细胞培养的单克隆性质。

3、  单个B淋巴细胞的培养上清可以快速高效地服务于早期高通量筛选，如ELISA、Western Blot及FACS等，按需要选择性地克隆阳性B细胞克隆的抗体基因，大大减少了工作量和筛选时间，提高了效率。

4、  分选后的单个B细胞经培养数周之后，可扩增至2⁸-2¹¹个细胞，可以提供足量的RNA来高效扩增出抗体重链和轻链基因。在高保真的PCR聚合酶的帮助下，大大减少扩增片段中随机突变的可能。

5、  与杂交瘤融合技术不同，SMab^TM技术平台培养B细胞的培养基中不含有HAT等选择培养基，无细胞毒性，可以直接用于一些基于细胞的功能性筛选（Cell Based Functional Assay），尤其适用于细胞表面抗原和配体-受体的抗体研发。

6、  SMab^TM平台所开发的抗体基因序列信息明确且为天然的轻重链配对，利于抗体的长期保存和生产。

优睿生物自成立至今，已经成功的利用SMab^TM技术平台进行兔、人源化小鼠甚至于人的单克隆抗体的筛选。尤其是对兔单克隆抗体的筛选上面，优睿生物完全打破了Abcam和CST公司在兔杂交瘤细胞上的技术垄断，利用SMab^TM技术平台成功的为客户以及自己开发了近100种单克隆抗体，其针对的靶标包括：翻译后修饰（磷酸化、棕榈酸化）位点、小分子有机化合物（维生素D、甾醇类等）、核酸片段以及一些与肿瘤免疫治疗相关的热门靶点蛋白等。利用SMab^TM技术平台开发单克隆抗体，所需周期短，且所开发的单克隆抗体具有亲和力高、特异性好等特点，受到了各方客户的一致好评。我们相信SMab^TM平台在单克隆抗体研发中必将大放异彩，不仅仅为客户提供优质的单克隆抗体开发服务，而且能够推出越来越多性能优越的各类单克隆抗体产品。