【技术干货】假病毒中和实验问答贴

部分病毒主要由囊膜、衣壳、核酸等物质组成，其囊膜上存在的“包膜蛋白”通常与特定的细胞表面受体相互作用，促使病毒通过内吞等过程进入细胞；而病毒中的核酸包含了其遗传信息，这段核酸进入细胞后，可以指导其自身的相关蛋白合成，完成病毒的复制过程。“假病毒”的“假”主要指病毒颗粒中的核酸发生了改变，使得病毒失去复制能力，因而使得假病毒没有致病能力，较“真”病毒更加安全。一般来说，真病毒实验需要在生物安全等级3级或以上实验室开展，而假病毒实验可以在生物安全等级2级实验室中进行。对于新冠S蛋白假病毒还有第二个“假”，即病毒骨架上的包膜蛋白被替换为了新冠病毒的Spike蛋白，因而使其可以模拟新冠病毒入侵细胞的过程。

新冠S蛋白假病毒的用途是模拟新冠病毒入侵细胞，那么其性质与新冠病毒越接近，模拟程度当然就越高。如果可以的话，最理想的是使用新冠病毒作为新冠假病毒的病毒骨架。但病毒的基因组是相当复杂的，其复制组装过程也受到复杂的调控，一个可用于制备假病毒的病毒骨架的开发和技术方法的成熟化、稳定化需要一个过程。目前，HIV-1病毒骨架无疑是研究最多、成熟度最高的病毒骨架之一，例如说常用于将特定基因导入细胞基因组的“慢病毒载体”通常就是以HIV-1为骨架。当然，除了HIV-1，人们也陆续开发了多种病毒骨架，由于原始病毒本身性质不同，各个骨架的优缺点也不尽相同。在其他条件可满足的前提下，建议选择颗粒形态、大小与新冠病毒比较接近的病毒骨架制备的新冠S蛋白假病毒。当然，我们还是非常期待新冠病毒骨架的诞生。

假病毒的包装即是将2、3、4甚至更多个质粒共转入HEK293T细胞中，这些质粒中含有指导病毒合成的全部基因，一段时间后，假病毒即产生。HIV-1骨架的新冠假病毒将存在于细胞培养液中，收集上清液，经过纯化即可获得新冠S蛋白假病毒悬液。

为了尽可能还原病毒入侵过程，假病毒包装过程中使用的包膜蛋白为近乎全长的新冠S蛋白基因序列，并使用人源细胞包装病毒，理论上S蛋白将在病毒包膜上呈现真实情况下的“三聚体”形式，并被糖基化，且具有构象变化的能力。考虑到新冠病毒和HIV-1病毒组装过程的差异，仅于S蛋白胞内段的片段（内质网定位信号）进行了截短以增加病毒包装效率；由于该截短与S蛋白胞外段跨膜区无关，对病毒入侵的影响较小。

假病毒由于不能复制或感染机体更多细胞，失去了致病性，具有相对的安全性。然而实验者依然应该警惕，在生物安全2级实验室的生物安全柜中谨慎操作，皮肤或粘膜不应触碰假病毒，加样、吹吸等操作时尽量轻柔并及时关盖，以减少气溶胶的产生。实验结束后所有沾染垃圾应妥善处理。

目前真/假病毒实验、ELISA三种方法常被用于评价疫苗及抗体药物等的中和能力。 毫无疑问，真病毒实验最高程度地还原了病毒的侵染过程，但由于其较高的高危险性，需要具备生物安全等级3级或以上实验室及其他必要的资质和技术才可以开展。此外，真病毒感染细胞后，一般需要通过观察细胞病变判断感染情况，观测过程相对繁琐。

假病毒实验仅需要生物安全等级2级实验室即可开展，且假病毒在高度模拟病毒的入侵过程的同时通常都插入了一段报告基因，如萤火虫萤光素酶，这使得实验者可以很容易对病毒入侵强度进行定量。但目前的新冠S蛋白假病毒都是以其他病毒为骨架，相对于新冠真病毒会有一定的差异。

ELISA是一个基于蛋白的高度抽象化的模型，它主要模拟了病毒入侵过程中病毒包膜蛋白和受体结合的过程，相对病毒来说更为简单，所以实验的稳定性、原材料的批间差可控性均较高。但ELISA实验由于抽象程度高，离开了病毒载体等因素后一定程度引入了假阴性和假阳性。

综上，在有条件的情况下，真病毒实验是理想的选择；对于病毒入侵机制十分清楚，需要实验稳定性高的实验，ELISA可以选择；对于如新冠病毒危险性较高，或入侵机制还不十分明确的病毒，或者尽可能减少假阴性和假阳性的出现，假病毒实验是不错的选择。

病毒滴度测定指通过生物学方法测定有感染能力的病毒颗粒的方法，其中也包括多种方法，目前最常用的是TCID50(半数组织培养感染剂量)测定，即准备6孔细胞，每孔中加入1 mL病毒悬液，其中有3孔(50%)萤光值达到了设定的阈值，那么这批病毒的滴度就是1 TCID50/mL。由于TCID50的测定受到阈值选取、实验平台(检测时间、仪器敏感性等因素)等影响较大，如果以此为定量方法，建议在特定实验平台，多次测定取平均值作为病毒滴度。 通过多次实验，我们发现病毒的TCID50滴度与特定量病毒感染细胞后的信号读值有正相关性。因此，一般来说通过一个在特定实验平台上的预实验测定可以使得对照组的萤光信号值在预期范围的病毒体积即可确定病毒用量。我们建议病毒对照组(加入病毒和细胞)应达到细胞对照组(只加细胞)的1000~10000倍，至少超过100倍以保证信噪比在100倍以上，且较多数据点出现在定量限以上。另外，应调整病毒用量，使不同批次病毒或不同突变株病毒感染细胞后萤光强度均在此范围内，确保相近的病毒用量，增强保证数据可比性。

萤光虫萤光素酶具有较高的灵敏度，在定量实验中建议以此为报告基因。如果需要拍摄图像，则需要使用绿色荧光蛋白报告基因。由于报告基因的灵敏度存在差异，绿色荧光蛋白报告基因不可以直接使用通过萤火虫萤光素酶报告基因摸索到的实验体系，应重新摸索合适的病毒用量和孵育时间。我们建议以萤光素酶对应病毒量的20倍为起点，进行预实验以摸索绿色荧光蛋白合适的对应病毒量；同时，48 小时后每隔24小时观察以寻找最合适的观测时间点。

在病毒量不变的情况下，注意实验细节可以使信号值提升数倍。首先，可以选择易感细胞株(ACE2过表达细胞株) ，ACE2的过表达程度会影响细胞易感性。同时，与新冠S蛋白假病毒入侵相关的其他基因的表达情况，也会对最终读值产生影响。其次，由于病毒入侵后需要通过细胞增殖及基因表达才会产生更多可以产生萤光素酶的细胞，细胞在实验前应处于较好的状态对于信号读值也十分重要。因此实验时消化、接种细胞的过程应轻柔迅速，消化及细胞从培养箱拿出后的放置总时间均不能过长。此外，细胞的接种密度、孵育时间及优质的萤光检测试剂与高灵敏度的检测仪器同样重要。在萤光检测试剂的选择上要注意试剂的半衰期，如果试剂的半衰期较短应该在试剂充分反应的前提下尽快完成读数，否则读值会迅速降低，此外，“一步法”萤光检测试剂会受到酚红、血清等成分的影响，使用无酚红培养基，或在检测时将培养基更换为等体积PBS，也可增强信号读值。最后，应尽量避免假病毒的冻融，每次冻融都会导致假病毒的滴度下降。

假病毒实验差异主要包括同次实验复孔间的差异，以及独立重复实验的信号读值差异。复孔间的差异产生的主要因素包括病毒感染细胞的随机性以及实验操作的不稳定性，建议在可接受的前提下适当增加病毒用量，以减少病毒感染过程的随机性引起的变异，实验操作确保熟练、精准、规范，或使用自动化仪器设备辅助加样等操作。独立重复实验信号差异主要由细胞状态、检测试剂状态等影响，萤光素酶报告基因的原理是该酶催化ATP、氧气和萤光素反应，反应过程中发光。由此可见，任何影响检测时细胞中的萤光素酶及ATP含量的因素都会对反应强度产生影响。因此，每次实验前应确保细胞处于接近的状态，实验过程中操作尽可能稳定，确保对细胞状态产生的影响程度接近，试验所有试剂耗材、孵育时间等确保一致。作为酶促反应，该反应对温度敏感，添加检测试剂前，需确保细胞培养板、检测试剂均已平衡至室温，实验环境温度稳定；由于检测试剂半衰期可能较短，每次实验添加检测试剂后，应等待较短的、相同的时间后进行检测。

HIV-1属于“慢病毒”，以此为骨架的假病毒，其携带的报告基因需要经过反转录、基因组整合、转录翻译等过程才能最终产生萤光素酶。因此，病毒感染后需要等待足够的时间再进行检测。实际实验中，我们发现可以在24~72h进行检测。考虑到慢病毒基因的表达需要一定时间，而时间过长可能导致细胞增殖过密，我们建议在48 h进行检测。而对于GFP荧光成像实验需要72~96 h，如果细胞密度过大可在48 h时对细胞进行一次传代。

理论上假病毒中含有的是萤光素酶基因，加入检测试剂后不会产生萤光，但实际上假病悬液是有相当强度的萤光的。这主要是因为病毒包装过程中，导入到包毒细胞中的质粒中的基因也会被包毒细胞识别，转录翻译产生报告基因编码的蛋白。这些蛋白可能意外被病毒颗粒包裹，也可能因细胞破裂散落在培养液中。但经过实验，我们发现病毒感染48 h后，细胞培养上清中检测不到假病毒悬液中的萤光，即假病毒悬液中的萤光素酶不会对最终的检测产生影响。如果实验者想在病毒感染后等待更短的时间即进行检测，建议检测前彻底去除细胞培养上清。

首先，选择对于特定实验平台，理想的病毒骨架、质粒系统包装的假病毒。其次，假病毒实验成本较高，选择性价比高的产品十分必要。第三，考虑病毒的批间差。由于病毒的包装基于多质粒的瞬转，不稳定性高，假病毒产品往往具有多至10倍的批间差。因此，选择一款批间差相对较小、萤光信号值及IC50值相对稳定的产品可以增强不同次实验的可比性。第四，病毒应可以被有效样品较好地中和。如果假病毒产品纯度较低，可能会出现中和不到底的情况，即使用一个已被证实可高以中和该突变株的抗体进行实验，不论如何增加抗体量，抑制率可能都无法达到90%以上。第五，确认突变位点，很多突变株会有多个突变位点的版本，这可能来自不同病例的测序结果，不同产品选择的参考序列也不尽相同，应确定某产品的突变位点与实验者预期一致。最后，综合考虑假病毒对于待测样品（血清/抗体/小分子/其他）的适用性、稳定性，安全性等因素。

ACROBiosystems假病毒具有较高的滴度，以野生型和Omicron突变株假病毒为例，感染细胞后信号值可以达到106级别。当然，该读值也依赖于熟练的实验操作与高灵敏度的仪器试剂。

赖于良好的批间差控制方案和严格的质检放行标准要求，ACROBiosystems 的假病毒具有较低的批间差，以野生型假病毒为例，不同批次的假病毒萤光信号值和检测同一样品的IC50值的批间极高和极低值差别分别在约2倍和3倍的水平。

经验证，ACRBiosystems 的假病毒适用于抗体、血清样本的中和实验。其中，在一个假病毒-抗体中和实验实例中，可以发现新冠(WT) Spike蛋白假病毒(Cat. No. PSSW-HLGB001)与新冠(Omicron) Spike蛋白假病毒(Cat. No. PSSO-HLGB003)均可被Spike RBD中和抗体(Cat. No. SPD-M265, S1N-M122)中和，抑制率达99%以上；已被报道Omicron突变株可逃逸的中和抗体REGN10987可以中和新冠Spike蛋白（WT）假病毒（Cat. No. PSSW-HLGB001），但无法有效中和新冠Spike蛋白（Omicron）假病毒（Cat. No. PSSO-HLGB003）。

经验证，在常规细胞培养基不添加，添加2.5%或5%阴性人血清的条件下，ACROBiosystems假病毒对同一抗体的中和效果接近。结合其他实验数据，我们认为应因添加样品导致额外血清含量不超过5%，或PBS含量不超过10%的情况下，基质效应对实验结果的影响程度是可接受的，这为中和实验带来了更多便利。

ACROBiosystems 可提供多种不同新冠突变株S蛋白假病毒及假病毒中和实验所需的ACE2过表达细胞株细胞株、与WHO标准物质对标，适用于野生型及多种突变株中和实验的阳性对照抗体（S1N-M122），及其他性质各不相同的相关抗体产品。