双特异性抗体：1+1>2，能单抗所不能
单抗药物只能结合单一靶点，发挥单一的生物活性。然而，在肿瘤、自身免疫疾病等治疗中需阻断多重信号通路避免代偿效应，此外，对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率常需要结合多抗原位点组织病毒逃逸。因此，单抗药物在这些领域的应用受到了一定的限制，而借助DNA重组和蛋白质工程技术手段构建的双特异性抗体成为抗体药物新的研究方向之一。双特异性抗体能单抗药物所不能，实现1+1>2的功效。根据报道，目前有上百个双抗药分子正在临床试验中，未来几年或将迎来全面爆发。生物技术的蓬勃发展也为双特异性抗体的研发带来了新的契机。
双特异性抗体生物活性分析：结构vs质量属性与PK方法开发
双特异性抗体有不同的结构形式：类似IgG结构，非IgG结构，对称结构，非对称结构【1】，等等……对于这些新型的结构，双特异性抗体的质量属性与PK/PD分析尤为重要。
FDA发布的2019版《Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry》【2】对于双特异性抗体的质量属性有以下描述：双特异性抗体的质量属性，例如抗原特异性；亲和力和on/off速率；亲合力（针对靶向同一细胞上两个分子的双特异性抗体）；效力与过程相关的杂质：聚集体，片段，同聚物；稳定性；半衰期可能会影响药理作用，应加以研究。
由于双特异性抗体可能以生物活性形式和非活性形式的混合物形式存在，因此要确定与PK/ PD评估最为相关的双特异性抗体形式，并开发可定量的、经过验证的多种测定方法。总的来说，还是定量总的、结合和未结合的双特异性抗体的水平。另外，由于双特异性抗体发挥了更多效能，较单抗来说，使用剂量可能会减少，所以需要建立灵敏度更高的活性方法。
双特异性抗体分析案例
基于早期的抗原-抗体亲和力检测，如亲和力和on/off速率，选择具有最佳亲和力、最佳功能和稳定性能最好的构建体，这点对于效应细胞-靶细胞构造的双特异性抗体特别重要。因为靶向CD3可能会过度活化T细胞和其他免疫细胞，导致过多的细胞因子被释放出来，在使用上会有安全性的考量，所以目前靶向CD3的抗体中，如果保有Fc区域，需要注意降低Fc与FcγR的结合，进而减少副作用的产生。
以ACROBiosystems基于蛋白结构分析和目标应用产品设计开发的CD3E&CD3D 1:1 异源二聚体的活性验证分析为例，我们用MALS验证了蛋白纯度，用SPR、ELISA assay等方法验证了蛋白与临床双特异性抗体CD3×BCMA（AMG420）的结合活性。
Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His Tag&Tag Free (Cat. No. CDD-H52W1) on SDS-PAGE under reducing (R) and non-reducing（NR）condition. The purity of the protein was more than 85% and around 35-43 kDa verified by SEC-MALS.
图1. 非还原电泳和MALS技术严格确认为1:1异源二聚体的CD3E&CD3D蛋白
Bispecific T-cell Engager (CD3 X BCMA, AMG420) immobilized on CM5 Chip can bind Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His Tag & Tag Free (Cat. No. CDD-H52W1) with an affinity constant of 31.8 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200).
图2. 经过Biacore活性验证的 CD3E&CD3D蛋白
Immobilized Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His Tag&Tag Free (Cat. No. CDD-H52W1) at 2 μg/mL, add increasing concentrations of Bispecific T cell Engager (CD3 X BCMA) and then add Biotinylated BCMA Fc,Avitag (Cat. No. BC7-H82F0) at 0.2 μg/mL. Detection was performed using HRP-conjugated streptavidin with sensitivity of 4 ng/mL.
图3. 经intact assay验证的CD3E&CD3D蛋白
类似IgG结构的双特异性抗体保有原有的Fc区域，具有IgG抗体的生物学活性与药代动力学特性及作用。我们用Biacore的方法验证了含有IgG结构的双特异性抗体与Fc gamma Receptor的亲和力情况。
图4. 双特异性抗体与FcR结合
双特异性抗体药物的生物活性方法开发，如PK方法分析，因生物样本中含有游离的靶点或者抗药抗体的干扰，所以通常需要一个以上的方法进行表征。
Intact Assay：
进行完整的双特异性抗体分子检测，任何功能区均未被ADA或游离靶点阻断，可评估最具活性的游离的双特异性抗体分子暴露，可用重组抗原（检测蛋白可考虑标记类重组蛋白）或者竞争性抗独特型抗体进行方法建立，该方案特异性高，基质效应影响小，灵敏度高。
Free A/B Assay：
分别针对其中一个功能区进行分析模式建立，可分别评估其功能区的活性及暴露，并考察ADA或游离靶点对相应功能区的影响，可用单臂抗原与通用型检测抗体进行方法建立，但该方案做临床PK方法开发可能会有基质效应影响或者存在空间位阻影响，因而灵敏度不高。
Total Assay：
总抗体分析模式将不受ADA及游离靶点的干扰，可针对双特异性抗体分子骨架部分进行方法建立，此模式有助于评价毒性暴露，可用通用型检测抗体（临床前）或者非竞争性抗独特型抗体（临床）进行方法建立。
图5. 双特异性抗体PK分析方法
Case-study3：
双特异性抗体的intact assay
我们用intact assay的方法，基于MALS verified 的OX40 蛋白以及生物素标记的CTLA-4建立游离型CTLA-4 x OX40双特异性抗体型抗体的ELISA分析模式，并进行方法学验证。
Immobilized Human OX40 Protein, His Tag (MALS verified) (Cat. No. OX0-H5224) at 2 μg/mL, add increasing concentrations of CTLA-4 x OX40 bispecific antibody in 50% Human serum and then add Biotinylated Human CTLA-4, Fc,Avitag (Cat. No. CT4-H82F3) at 0.2 μg/mL. Detection was performed using HRP-conjugated streptavidin with sensitivity of 4 ng/mL (Intact assay).
图6 双特异性抗体（CTLA-4 x OX40）的Intact assay
方法学验证：
在建立PK方法的时候，需要综合考虑各种检测方法的优缺点，根据灵敏度要求，选择合适的检测模式与平台用于方法开发，然后通过对不同条件的优化，最终成功得到可满足测样需求并符合指导原则要求的分析方法。
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【1】Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0028-1.
【2】Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry DRAFT GUIDANCE.
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