上周我们对基于高质量重组蛋白的双特异性抗体生物活性分析进行了案例分享（错过的小伙伴可以点击文末链接进行查看哦~），今天我们来聊一聊双特异性抗体的理化分析吧！
双特异性抗体（BsAb）作为新一代抗体药物，因其特殊的结构设计而具有强大的功能。正所谓“成也萧何，败也萧何”，特殊的结构设计也导致双特异性抗体的异质性。虽然可以采用抗体工程技术来指导BsAb的正确配对，但是实验验证仍然有因为错配而产生的异质抗体。此外，氨基酸序列的改变可能会引起蛋白质修饰的差异，进而影响抗体的性质并进一步增加结构的复杂性。
目前已经有许多方法可以用来表征抗体异质性，而高效准确地进行样品前处理是分析的准确性的首要条件。
抗体药物的亲和力分析通常采用表面等离子体共振技术（SPR）进行。实验发现，如果直接对完整的抗体采用SPR进行亲和力测定，会因Avidity效应而导致亲和力结果偏高。亲和力的测定是药物筛选的重要环节，抗体Fab段和靶点的亲和情况会影响最终的药效。
因此，在对抗体进行亲和力测定前需要进行预处理。通过蛋白水解酶对抗体进行酶切，使其裂解为Fab和Fc片段，然后对Fab进行富集纯化再进行SPR检测可以避免Avidity效应带来的影响，准确进行亲和力的测定。由于双抗药物能够同时识别并结合不同的抗原靶点，其抗原-抗体亲和力的准确测定显得更为重要，对样品的准确预处理也提出了更高的要求。
那么，如何高效准确地对抗体进行酶切呢？这就对使用的蛋白水解酶提出了要求。目前多种类型的蛋白水解酶如Papain，Trypcin以及Pepsin等都可以用于抗体的酶切，其中Papain可以将抗体水解为2个Fab和1个Fc片段，但是存在非特异性酶切以及酶切过度的问题，因此需要对反应条件进行优化。
2017年的一篇文献中则报道了Roche采用来源于Porphyromonas gingivalis的一种特异性的抗体蛋白酶GingisKHAN（货号：B0-GKH-020）成功的应用于单抗和双抗的预处理，该酶可以特异有效地针对抗体进行高效酶切，且不会过度酶切。
Fig. 1. Avidity and affinity measurements by surface plasmon resonance (SPR) of antibodies and Fabs binding di- or multimeric targets.
为了比较Papain和GingisKHAN两种酶切体系的酶切效果，他们对酶切后的产物进行了质谱分析，结果显示GingisKHAN将抗体有效的切成了Fab片段和Fc段，且片段大小与预测结果一致。而Papain的酶切体系酶切后的产物质谱分析谱图中除了Fab段和Fc段的特征峰外，还出现了多个杂峰，这是由于Fc段的糖基化异质性导致不同类型的Fc聚集而产生的非特异性片段。
Fig. 2. UHR-ESI-QTOF mass spectrometry of mAb. Deconvoluted mass spectra of (B) mAb1 digested with GingisKHAN, (C) mAb digested with papain (1 h).
仅凭酶切效果就断定GingisKHAN酶切体系更好似乎有些武断。研究人员对酶切处理后的片段进行纯化，通过SPR进行抗原-抗体亲和力的测定，结果显示，两种方案的结果是完全一致的。同时为了评估过度酶切对于亲和力测定的影响，设置了一个Papain酶切3.5h的实验组，结果发现过度酶切后抗体与抗原完全不结合，酶活完全丧失，因此采用Papain等常规的酶进行预处理时，需要进行条件优化，以确保亲和力测定结果的准确性。
Fig. 3. Affinity determinations by surface plasmon resonance of mAb1 and Fabs thereof. Sensorgrams of (B) mAb1 digested with GingisKHANTM, (C) mAb1 digested with papain (1 h, subsequently inhibited with antipain), (D) mAb1 digested with papain (3.5 h, subsequently inhibited with antipain), The analyte was injected in a dilution series ranking from 2.2 to 1800 nM (colored sensorgrams). The black curves are the fitting curves using models from BIAevaluate. The arrows indicate the faster dissociation of the Fabs (B, C, E, and F) relative to the IgG1 (A).
除了常规的单抗和双抗药物，一些双特异性抗体在开发的过程中会进行Fc段的改造，科研工作者需要设计不同的酶切方案进行抗体的预处理。Gst€ottner在文章中分享了他针对不同突变体双抗进行预处理的策略方案，针对合适的位点选择高效的蛋白酶（IdeS，货号：A0-FR1-020和SpeB，货号：A0-PU1-020）进行酶切预处理（Fig.4）。
Fig. 4. Comparison of amino acid differences between BsAb1 and BsAb2. Exchanged amino acids are shown in red. Glycans are removed for simplicity. Hinge region cleavage and reduction of BsAbs leading to six different subunits. B) IdeS digestion and reduction of BsAb1. C) SpeB cleavage and reduction of BsAb2. Red stripes in the Fc indicate LALA PG mutation.
Mingyan Cao等人在对复杂性更高的scFv融合双抗的分析过程中提出IdeS(货号：A0-FR1-020)/PNGase F/Cpb混合酶切方案进行预处理，正确地对抗体进行异质性分析并得到了不错的结果(Fig.5)。
Fig. 5. IdeS digestion scheme and masses of (Fab′)2 and Fc/2 after IdeS digestion. (A1) (Fab′)2 of fraction 1; (A2) (Fab′)2 of fraction 2; (A3) (Fab′)2 of fraction 3; (B1) Fc/2 of fraction 1 after IdeS digestion; (B2) Fc/2 of fraction 2 after IdeS digestion; (B3) Fc/2 of fraction 3 after IdeS digestion; (C1) Fc/2 of fraction 1 after IdeS/PNGase F/CpB digestion; (C2) Fc/2 of fraction 2 after IdeS/PNGase F/CpB digestion; (C3) Fc/2 of fraction 3 after IdeS/PNGase F/CpB digestion.
选择合适的酶产品进行酶切，进行有效的预处理，对于抗体的理化分析至关重要，决定了亲和力测定的准确性和药物异质性情况的评估。
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