【新冠专栏】细数D614G突变对Spike蛋白结构与功能的影响

D614G突变株是指新冠病毒表面的刺突蛋白（Spike protein）第614位的氨基酸由天冬氨酸（Aspartic acid, D）突变为甘氨酸（Glycine, G）。由于D614G突变株在全球范围内已经成为新冠病毒主流毒株，并且D614G突变发生在新冠病毒识别宿主细胞的刺突蛋白上，因此研究人员对此突变位点格外关注，试图尽快确定D614G突变是否会影响病毒的传染性以及毒力。

10月初，来自美国的科研人员在《细胞》杂志上发表文章 Structural and Functional Analysis of the D614G SARS-CoV-2 Spike Protein Variant ¹，通过细胞生物学和结构生物学的方法对D614G突变进行了深入研究，接下来我们将对这项研究成果进行解读。

根据权威组织——全球共享流感数据倡议组织(GISAID)的统计数据，自从新冠疫情爆发后，D614G突变在已公布的新冠病毒序列中的占比稳定增加。截至2020年6月25日，此突变位点出现的频率已经达到74%，说明含有D614G突变的新冠病毒已经成为全球最流行的病毒株（图1）。

研究人员构建出分别表达原型及D614G突变型Spike蛋白的假病毒，然后用这两种假病毒去感染人源肺部上皮细胞Calu-3、人源结肠上皮细胞Caco-2、以及外源表达ACE2和TMPRSS2的HEK-293及SupT1细胞。研究人员发现表达D614G突变型Spike蛋白的假病毒在感染细胞后，其产生报告基因的信号比表达原型Spike蛋白的假病毒高出4-9倍（图2）。

新冠病毒Spike蛋白通过其RBD结构域与宿主细胞的受体ACE2结合，使得病毒能够识别宿主细胞，但D614G突变并不处于RBD结构域中，研究人员推测D614G突变可能不会影响Spike蛋白与ACE2的亲和力。为验证这一假设，研究人员利用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）方法进行检测，发现在25°C条件下下，D614G突变使得Spike蛋白与ACE2的解离速率提高4倍，从而导致Spike蛋白与ACE2的亲和力下降5.7倍；而在37°C条件下，研究人员得到的结果类似，D614G突变使Spike蛋白与ACE2的解离速率提高，导致Spike蛋白与ACE2的亲和力下降5倍。以上实验结果说明，D614G并不是通过提高Spike蛋白与ACE2的亲和力来增强假病毒的感染能力（图3）。

目前绝大多数新冠病毒的中和抗体都以Spike蛋白的RBD为靶点，通过阻断RBD与ACE2的结合来阻止病毒感染宿主细胞。尽管D614G突变不位于RBD上，但人们依然担心D614G突变会影响这些中和抗体的抗病毒能力。研究人员利用假病毒系统对再生元（Regeneron）的4株全人源新冠中和抗体进行检测，发现D614G并不会影响这些抗体中和假病毒的能力，抗体的IC50值差异很小（图4）。

在新冠原型Spike蛋白三聚体结构中，Spike蛋白主要存在两种组分，一种是三个Spike蛋白中的RBD全部处于“关闭”状态，这种组分占比为46%；另一种是三个RBD中有1个处于“打开”状态，另2个处于“关闭”状态，这种组分占比为54%²。因为RBD处于“关闭”状态时无法结合受体ACE2，因此Spike蛋白中RBD处于“打开“状态被认为是新冠病毒识别宿主细胞的起始（图5）³。

为进一步研究D614G突变对Spike蛋白空间构象的影响，研究人员利用冷冻电镜的方法解析了含有D614G突变的Spike蛋白三维结构，并同原型Spike蛋白的结构进行比较。通过对比发现，Spike蛋白S2亚基的空间位置没有明显变化，但D614G突变使Spike蛋白S1亚基偏离原型蛋白中的位置，导致获得的Spike蛋白中只有5%的组分处于3个RBD全部“关闭”的状态，有36%的组分处于1个RBD“打开”的状态, 有39%的组分处于2个RBD“打开”的状态, 有20%的组分有3个RBD全部处于“打开”的状态。由于有更多RBD处于“打开”的状态，因此可能导致Spike蛋白更容易与ACE2结合，促进新冠病毒感染宿主细胞（图6）。

当前全球有接近200个新冠疫苗项目正在推进中，在评价疫苗有效性时，疫苗公司和研究院所通常会使用原型Spike蛋白或RBD蛋白作为抗原检测样本中的抗体滴度。与其它公司不同，美国Moderna公司已经开始使用含有D614G突变的Spike蛋白进行抗体检测，值得引起注意⁵。