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【新品上线】pH敏感染料的抗体内吞检测试剂——评估ADC内吞的利器
发布日期：2025-04-27
浏览量：94
抗体偶联药物（ADCs）由单克隆抗体与高效细胞毒性载荷通过连接子共价连接，通过抗体实现了对癌细胞表面抗原的特异性识别与结合，从而将毒性药物精准递送至肿瘤细胞，极大降低了对正常组织的毒性。这一过程的依赖于ADC药物的核心作用机制——内吞作用。
ADC与癌细胞表面抗原的结合，形成ADC-抗原复合物，经由内吞途径被细胞内化，进而形成早期内体。早期内体被转运至晚期内体和溶酶体，进而被酶解或化学裂解，释放出具有活性的细胞毒性药物。这些释放的药物随后发挥其强大的抗肿瘤活性，包括破坏DNA复制过程或干扰微管功能，最终导致癌细胞的凋亡或死亡。
ADC的经典作用机制(来源：https://doi.org/10.1038/s41392-022-00947-7)
因此，内吞检测不仅是药物筛选的关键步骤，更是机制优化的核心手段。通过量化内化效率，科研人员能精准预测ADC在体内的行为模式，为临床试验提供关键数据支持。如何精准评估ADC的内吞效率？不同检测方法又有哪些独特优势与局限？本文将带您深入探索这一领域的核心密码。
共聚焦显微镜细胞内定位法
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原理：用荧光染料标记抗体，将荧光标记的ADC与细胞共孵育，利用激光扫描共聚焦显微镜逐层获取细胞三维图像，通过追踪荧光信号，实时观察ADC内吞后在亚细胞结构（如内涵体、溶酶体）中的动态分布。
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优势：直观显示ADC在内涵体/溶酶体中的定位，为研究内化路径与药物释放机制，提供高分辨率可视化数据。
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缺点：无法定量，观察者经验可能影响结果解读。
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实际应用案例：在前导优化阶段，共聚焦成像技术被用于评估抗体结构优化对内吞过程的影响。
流式细胞术
流式细胞术在细胞中ADC内吞的定量分析方面发挥着举足轻重的作用，可定量评估ADC的内吞效率。
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原理：使用荧光分子（如Alexa Fluor 647）偶联ADC，通过抗荧光标签的二抗（如抗荧光淬灭抗体）选择性淬灭细胞表面残留信号，仅保留内吞的ADC荧光信号。
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优势：操作简便；适合大规模筛选；能够定量评估且快速比较不同ADC候选分子的内化效率。
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缺点：仅能获取“终点数据”（如内化比例），无法捕捉ADC内化的动态过程；复杂样本可能影响检测精度；些情况下，如细胞表面荧光淬灭不完全，可能产生假阳性结果，影响实验准确性。
毒素偶联测定技术
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原理：通过将抗体与细胞毒性毒素（如白喉毒素、假单胞菌外毒素A或蓖麻毒素A链）偶联，构建"免疫毒素"复合物。该复合物依赖抗体的靶向性结合肿瘤细胞表面抗原，随后通过内吞作用进入细胞。毒素在细胞内释放后，通过抑制蛋白质合成（如核糖体失活）诱导细胞死亡，其毒性效应与内吞效率直接相关。
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优势：由于毒素介导的信号放大效应，使得该技术具有极高的灵敏度；可适配96/384孔板，支持抗体库的高通量筛选。
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缺点：易受非特异性细胞毒性作用影响，可能产生非特异性毒性干扰；无法区分内化途径差异（如网格蛋白依赖/非依赖）。
免疫毒素诱导的细胞毒性机制（来源：ProBio官网）
研发阶段与检测策略精准匹配
基于内吞检测在ADC研发中的核心地位，不同研发阶段需匹配相应的检测策略。
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抗体发现阶段：需快速筛选能特异性结合肿瘤抗原且高效内化的抗体。此时，流式细胞术可发挥高通量优势，定量筛选内化效率；毒素偶联测定则通过功能验证，关联内化与细胞毒性，确保候选分子的有效性。
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药物优化阶段：需评估抗体结构或偶联化学对内化过程的影响。此时，共聚焦成像可动态追踪内化过程，揭示亚细胞定位，为结构优化提供直观依据；pH敏感染料法则能定量检测内涵体递送效率，同时保留抗体活性，支持多轮优化迭代。
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临床前开发阶段：需确认候选药物在不同细胞模型中的内化行为。此时，多平台联合检测（流式定量+成像定位+功能测定）可全面评估ADC的内化效率、稳定性及细胞毒性，提高药物开发成功率。
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作用机制研究阶段：需验证载荷的细胞内递送过程。此时，pH敏感染料法可精准量化内涵体递送，揭示递送机制；毒素偶联测定则通过剂量-效应关系建模，探究内化效率与细胞毒性效应之间的关联，为药物作用机制研究提供关键数据。
为满足ADC药物内吞检测的需求，ACROBiosystems百普赛斯开发了一种基于pH敏感染料的抗体内吞检测试剂（Cat.No. IGG-PZF2001），利用 pH 敏感的荧光染料标记F(ab')2 片段，此荧光标记试剂特异性结合待测抗体的 Fc 部分，10min即可形成稳定的抗体复合物，适用于快速评估抗体的内化过程，标记后抗体可用流式细胞术或细胞成像技术等多种方法检测。
产品特点
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高信噪比：阳性信号强，背景值低，信噪比高
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方便快捷：仅需10min即可完成抗体标记
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pH敏感：在酸性条件下发出明亮荧光，可用于胞内示踪
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不影响抗原结合：靶向抗体Fc端，保留抗原结合位点
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抗体内吞检测——FACS
Anti-CD20 Abs and Human IgG1 isotype control were labeled with Antibody Internalization Detection Reagent (Cat.No. IGG-PZF2001). Raji cells were treated with Anti-CD20 Abs-Internalization Detection Reagent conjugate and Isotype control-Internalization Detection Reagent conjugate separately for 2 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the activity (Routine tested).
Anti-Her2 Abs and Human IgG1 isotype control were labeled with Antibody Internalization Detection Reagent (Cat.No. IGG-PZF2001). SK-BR-3 cells were treated with Anti-Her2 Abs-Internalization Detection Reagent conjugate and Isotype control-Internalization Detection Reagent conjugate separately for 2 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the activity (Routine tested).
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抗体内吞检测——荧光成像
S A. Antibody Internalization Detection Reagent (Cat.No. IGG-PZF2001). B. IgG1 Isotype+Internalization Detection Reagent conjugate. C. Anti-Her2 Abs+Internalization Detection Reagent conjugate. D. Anti-Her2 Abs+Internalization Detection Reagent conjugate(Z-stacking). （Green: CellLights Lysosome GFP, Blue: NucBlue Live ReadyProbes, Red: IGG-PZF2001,Cell line: SK-BR-3 Her2+）
参考文献：
1.Shivatare VS, Huang HW, Tseng TH, Chuang PK, Zeng YF, Wong CH. Probing the Internalization and Efficacy of Antibody-Drug Conjugate via Site-Specific Fc-Glycan Labelling of a Homogeneous Antibody Targeting SSEA-4 Bearing Tumors. Isr J Chem. 2023 Oct;63(10-11):e202300042. doi: 10.1002/ijch.202300042. Epub 2023 Apr 22. PMID: 38348405; PMCID: PMC10861153.
2Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00947-7
Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye
3.ProBio CDMO. (n.d.). ADC bioassay services. https://www.probiocdmo.com/add-adc-bioassay-service.html
4.Nath N, Godat B, Zimprich C, Dwight SJ, Corona C, McDougall M, Urh M. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 2016 Apr;431:11-21. doi: 10.1016/j.jim.2016.02.001. Epub 2016 Feb 3. PMID: 26851520.
5. Li Y, Liu PC, Shen Y, Snavely MD, Hiraga K. A Cell-Based Internalization and Degradation Assay with an Activatable Fluorescence-Quencher Probe as a Tool for Functional Antibody Screening. J Biomol Screen. 2015 Aug;20(7):869-75. doi: 10.1177/1087057115588511. Epub 2015 May 29. PMID: 26024945; PMCID: PMC4512523.
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