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【技术干货】您的CAR表达检测试剂选对了吗？

2021-07-29 13:11    浏览量：3451

对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法（FACS）检测CAR转染阳性率。目前，针对CAR不同结构区域的检测方法，包括针对CAR抗原结合位点的，比如CD19抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体、Protein L蛋白。➞文末可下载细胞治疗质量控制相关指导原则和政策解读相关文件哦~

那么，如何选择合适的CAR表达检测试剂呢？接下来，小编结合各种检测试剂的检测原理和优缺点，帮您选择出最合适的CAR表达检测试剂~




通用型CAR检测试剂




1

抗Fab抗体

抗 Fab 抗体可识别抗体Fab段，可与含有Fab段可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的（图1），具有一定的通用性，可检测不同靶点的CAR。商品化的抗 Fab 抗体产品质量参差不齐且多数为多抗，批间一致性较差。来自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F(ab)2 抗体是目前使用最广泛的抗Fab抗体，曾用于上市药物Yescarta 的抗 CD19 CAR表达检测[1]。

2

Protein L

是一种消化链球菌的表面蛋白，Protein L可识别抗体的Kappa轻链，可与含有Kappa可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的（图1），可用于检测人 VKI、VKIII、VKIV亚型和鼠VKI亚型的CAR，但不能检测人VκII亚型和鼠Ig的其他亚型的轻链。Protein L也具有一定的通用性，可检测不同靶点的CAR。需要注意的是，在Protein L 染色之前需要对细胞进行多次洗涤，严格去除血清或培养基中的残留免疫球蛋白，否则会出现严重的非特异背景。

图1 抗 Fab 抗体和protein L的CAR检测结合位点

要点

抗Fab抗体和 Protein L具有相对便宜的价格，但它们都有明显的缺点：

  • 染色前后需要严格洗涤，否则会与非 CAR的 IgG 样蛋白交叉反应而出现严重非特异；

  • 做多色染色时，与其他抗体或FcX封闭试剂不兼容；

  • 不能对双靶点CAR细胞上的单独CAR分别染色；

  • 不能对合成的CAR进行检测。





靶抗原蛋白




靶抗原蛋白可与scFv特异性结合，因此可作为CAR表达检测试剂。例如可使用N 端靶抗原与 C 端 Fc片段（通常来自人 IgG1）融合的靶抗原-Fc嵌合蛋白（如CD19-Fc、HER2-Fc 和 PSCA-Fc），对 CAR-T 细胞进行染色，再使用荧光标记的抗 Fc抗体或链霉亲和素（若靶抗原-Fc 已被生物素化）进行二次染色，可完成对CAR的检测；另外，如果靶抗原-Fc已经带有荧光标记染料，对CAR-T细胞染色后可直接进行FACS检测，避免二次染色出现的非特异背景，同时还节约了一半的时间。

要点

  • 可与CAR特异性结合，具有CAR功能性验证作用；

  • 可检测双靶点CAR-T细胞中单CAR的表达；

  • 荧光标记的靶抗原蛋白，可一步染色完成检测CAR表达，减少非特异背景并节约时间；

  • 还可用于激活 CAR-T 细胞；

  • 价格相对Protein L等通用型检测试剂较贵。




抗独特型抗体




抗独特型抗体可特异性结合CAR的scFv 可变区，具有较高的特异性和灵敏性。德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究团队开发的来自小鼠的抗 CD19 (FMC63) scFv单克隆抗独特型抗体（克隆 136.20.1），利用流式方法可特异性检测PBMC样本中的CD19 CAR表达，且灵敏度接近千分之一[2]。实际上，Anti-FMC63 scFv Antibody抗独特性抗体已被运用到多种临床前或临床阶段项目中[3]。

另外，抗独特型抗体分具有中和活性和无中和活性的抗独特性抗体，在进行临床PK研究时，使用具有中和活性的抗独特性抗体，可以检测到游离的CAR阳性T细胞（指没有跟体内抗原结合的CAR-T细胞），而使用没有中和活性的抗独特性抗体，检测的是总的CAR阳性T细胞量（包括跟体内肿瘤抗原结合和没有结合的CAR-T细胞）。
要点

  • 特异性结合CAR的scFv；

  • 高特异性和高灵敏度，且非特异背景低，适用于检测临床样本；

  • 具有中和活性的抗独特型抗体，可检测到游离的CAR阳性T细胞；

  • 具有靶点专属性，开发周期长；




图2 靶点蛋白和抗独特型抗体分别检测CAR阳性率的原理


总结

总体来看，Protein L、抗Fab抗体、靶抗原蛋白以及抗独特型抗体作为CAR表达检测试剂均有各自的优缺点，结合实际的应用情况，有以下几点建议供参考：

  1. 尽量不使用Protein L或抗Fab抗体，避免高非特异，导致实验结果不易分析；

  2. 抗体筛选、方法开发、质控等阶段建议选用抗原蛋白，保证筛选到的scFv具有功能性作用和质控方法的稳定性；

  3. 对于后期临床阶段来说，抗原蛋白为首选，来确保临床PK等药效学研究结果的可靠性，但对于临床样本，存在细胞组分比较复杂、CAR-T细胞含量较低等问题，导致CAR检测难度加大，因此，可选择灵敏度较高的抗独特型抗体检测临床样本。

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ACROBiosystems

我们提供CD19、BCMA、HER2、CD22、DLL3等50多种CAR-T靶点蛋白，涵盖Biotin、FITC、PE等多种标记类型，具有高特异、高灵敏、高批间一致的特性，经FACS验证适用于CAR表达检测。ACRO还开发了具有高特异性和高灵敏度的抗FMC63抗体，可高灵敏检测临床样本中的CD19（FMC63）CAR表达。


此外，我们的产品经PBMC批检放行，均显示与未转染CAR的PBMC样本无结合，高标准保证您的FACS检测信号来自靶抗原与CAR-T细胞的特异性结合，加速您的药物研发进程。




01
热门产品



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02
验证数据


PE标记CD19蛋白


可一步染色完成CD19 CAR表达检测

点击申请protocol


PE标记CD19蛋白


与未转染CAR的PBMC样本无结合

点击申请protocol


抗FMC63抗体


经FACS验证，可高灵敏检测CD19 CAR表达

点击申请protocol


抗FMC63抗体


经ELISA验证，具有中和活性，IC50 为0.084 μg/mL

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参考文献：

[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.

[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody to detect CD19-specific T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.

[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.     

[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.

[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS



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