TCE药物活性分析案例分享——细胞因子检测

T细胞衔接器（T Cell Engager, TCE）是一种双特异性抗体，可以同时靶向肿瘤相关细胞表面抗原（Tumor-Associated Antigen，TAA）和T细胞表面受体（T-Cell Receptor，TCR）。与传统单抗相比，TCE双抗的一个显著优势是其强大的专职细胞杀伤能力，通过直接招募激活T细胞，其能够诱导更强烈和更持久的免疫反应。

近年来，国内外多家公司加速推进TCE双抗的商业化，将其视为继ADC之后的新兴增长点。截止2024年12月，全球约有400+条在研的TCE双抗药物管线，且管线数量逐年增加。这其中针对非实体瘤（如多发性骨髓瘤和各类淋巴瘤）及血液病等适应症的管线共计占总管线数的50%以上，且其中约50%管线已经进入临床阶段。除此之外，TCE双抗在针对实体瘤的适应症上也占有约30%的管线数，且近期有所突破。2024年5月，安进宣布其研发的TCE抗体Tarlatamab（商品名称IMDELLTRA）可针对性治疗小细胞肺癌，并且已经获得FDA的加速批准上市。

TCE是一种新型抗体，具有独特的Fab端和Fc端结构。其作用机制（Mechanism of Action, MOA）在于一个Fab端结合特定的肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA），另一个Fab端结合T细胞受体（T-cell receptor, TCR），其中CD3是常见的靶点。这种双重靶向使TCE能够精准定位肿瘤细胞，同时将T细胞吸引至肿瘤细胞表面，激活T细胞并诱导肿瘤细胞杀伤。激活后的T细胞通过与肿瘤细胞形成免疫突触裂解肿瘤细胞，同时释放一系列细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10等），进一步增强T细胞增殖与抗肿瘤效应（图1）。此外，TCE的Fc端设计可以显著延长其半衰期，降低代谢速度，从而增强药效的持久性。

图1. TCE双抗的作用机制示意图

相比传统的IgG单抗，TCE双抗展现出显著优势。传统IgG单抗主要通过Fc端介导的ADCC、CDC和ADCP机制激活抗原呈递细胞，再由抗原呈递细胞激活T细胞。这一间接机制限制了单抗直接激活T细胞和杀伤肿瘤细胞的能力。而TCE双抗能够直接激活T细胞，显著提高抗肿瘤效果。

更重要的是，TCE的Fab端可以根据不同肿瘤类型的特异性TAA靶点进行定制化设计。例如，针对血液肿瘤的热门靶点包括CD19、CD20、BCMA；而针对实体瘤，常见靶点有DLL3、HER2和CLDN18.2等。

在早期药物开发和临床前阶段，研究人员通过体外培养刺激淋巴细胞分泌细胞因子，分析TCE药物对免疫细胞的刺激作用，从而评价其药效。以在2024年5月上市的靶向CD3和小细胞肺癌特异性抗原DLL3的TCE双抗Tarlatamab为例，其药物作用机制的建立包括了检测不同药物浓度刺激下，细胞上清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α细胞因子的分泌情况（图2）。

图2 Tarlatamab体外细胞刺激实验

同时，2014年批准上市的TCE药物Blinatumomab，它是T细胞表面CD3及大B细胞瘤特异性抗原CD19的靶向双抗。根据FDA上公布的临床实验数据，一系列细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12）被确立为临床阶段药效学中T细胞激活的的生物标志物（图3）。

图3. Blinatumomab临床实验中细胞因子标志物检测

综上，在TCE双特异性抗体药物开发过程中，细胞因子作为关键的检测指标，在早期药理药效研究、临床前及临床实验中，通过检测细胞上清/血清中多种细胞因子的分泌量，能充分反应机体免疫系统激活情况。

为了加速TCE药物研发，ACROBiosystems提供多种细胞因子（cytokine）、生物标志物（biomarker）的定量分析ELISA试剂盒。该试剂盒性能经过真实样本和实验的充分验证，保证分析结果的精确性、特异性、准确度、灵敏度和一致性。

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图4 TCE药物的T细胞激活实验

• 实验结果

效应细胞和靶细胞在E:T=1:10和1:5比例共培养下，随着药物浓度的增加，100ng/mL Blinatumomab 刺激下，其IFN-γ分泌量都比其他实验组要高（图5）。

图5 不同刺激条件下IFN-γ的释放

效应细胞和靶细胞在E:T=1:10和1:5比例共培养下，随着药物浓度的增加，IL-6，IL-10的分泌量都比对照组要高（图6）。

图6 不同刺激条件下IL-6，IL-10的释放

• ClinMax™人IFN-γ ELISA试剂盒（Cat. No. CRS-A017）

线性范围

ClinMax^TM人IFN-γ ELISA试剂盒的线性检测范围为19.5 pg/mL – 1250 pg/mL，具体数据见图7。

图7. (A). CRS-A017试剂盒标准品线性检测数据(OD450nm-630nm); (B). CRS-A017试剂盒标准品四参数方程拟合线性图

批内、批间精密度

按本产品（CRS-A017）操作说明，测定3个浓度的质控品，每个质控品重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于10%，具体结果见图8。

按本产品（CRS-A017）操作说明，测定3个批次3个浓度的QC（pg/mL），每个质控品重复检测3次，计算9次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于15%，具体结果见图8。

图8. (A). CRS-A017批内精密度数据图；(B). CRS-A017批间精密度数据图及CV值

回收率

将本产品（CRS-A017）中的参考品，用样本稀释液分别配置成高值血清样本，按照1：19的体积比例加标到血清样本中。按照试剂盒说明书，每个样本均检测2次，求出检测结果的浓度值的平均值。回收率的计算公式=（加标样本值-Blank样本值*0.9）/理论值×100%。本产品回收率都在93.5%的范围内（见下表1）。

表1. CRS-A017回收率数据

稀释线性

将本产品（CRS-A017）中IFN-γ参考品，用血清样本配置成为高值血清/血浆/细胞上清样本，用样本稀释液依次按1：1进行稀释，每个稀释浓度均检测2次，求检测结果的浓度值的平均值，结果显示，血清/血浆/细胞上清样本各稀释点的检测浓度应都在该待测物浓度标示值的±20%范围内，线性相关系数R²应大于0.95 (见图9)。

图9. CRS-A017稀释线性曲线图

• ClinMax™人IL-6 ELISA试剂盒（Cat. No. CRS- B001）

线性范围

ClinMax^TM人IL-6 ELISA检测试剂盒的线性检测范围为6.25 pg/mL – 400 pg/mL，具体数据见图10。

图10. (A). CRS-B001试剂盒标准品线性检测数据(OD450nm-630nm); (B). CRS-B001试剂盒标准品四参数方程拟合线性图

批内、批间精密度

按本产品（CRS-B001）操作说明，测定3个浓度的质控品，每个质控品重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于10%，具体结果见图11。

按本产品（CRS-B001）操作说明，测定3个批次3个浓度的QC（pg/mL），每个质控品重复检测3次，计算9次测量结果的平均值（M）、标准差（SD）和变异系数（CV）。结果显示，测定质控品的CV都低于15%，具体结果见图11。

图11. (A). CRS-B001批内精密度数据图；(B). CRS-B001批间精密度数据图及CV值

回收率

将本产品（CRS-B001）中的参考品，用样本稀释液分别配置成高值血清样本，按照1：19的体积比例加标到血清样本中。按照试剂盒说明书，每个样本均检测2次，求出检测结果的浓度值的平均值。回收率的计算公式=（加标样本值-Blank样本值*0.9）/理论值×100%, 本产品回收率平均值为92.29%（见下表2）。

表2. CRS-B001回收率数据

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